背景[1-5]

Miser Antibody Extender Solution NC可以显著降低使用硝酸纤维素膜进行蛋白质印迹所需的初级的抗体量。蛋白质转移到硝酸纤维素膜后，Miser Antibody Extender Solution NC处理只需几分钟即可完成一抗孵育。Miser Antibody Extender Solution NC处理后的Western印迹化学发光和显色检测方法表现良好。

一抗抗体量的减少会减弱抗原特异性，而且Miser Antibody Extender Solution NC不建议用于转移到PVDF膜的抗原一抗孵育处理。Werstern blot，是将印迹技术与抗原-抗体反应的特异性相结合的检测技术，用于分离和检测生物标本中的某一特定蛋白。其基本原理实混合蛋白质样本通过凝胶电泳分离后，通过特殊虹吸或电场装置印迹至固相介质（NC膜或PVDF膜）上，将针对待测蛋白的特异性抗体作用于滤膜上，利用抗体上偶联的酶降解底物在滤膜上生成有色沉淀物或化学发光产物，从而显示出待测蛋白的存在及量。

实验流程：

一.样本制备

样本的来源：细胞培养上清；细胞（胞浆蛋白、胞膜蛋白、胞核蛋白）；组织匀浆；蛋白的提取：（裂解前加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂使其终浓度为1mM）样本上样前的处理:蛋白提取液和SDS上样缓冲液（Loading buffer）以一定的比例上样；蛋白变性：95-100℃变性5分钟（为了能使抗体接触到抗原表位，必须将蛋白的三维结构打开，因此需要将蛋白变性，核蛋白要增加裂解液体积和超声破碎次数，煮样时间延长至10-15min）。

二、上样与电泳

原理：裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。

上样：一般每孔上样20-50ug总蛋白，100ng纯蛋白。根据胶的厚度不同，上样总体积也不同：一般来说，10mm的胶最多可上样20ul；15mm胶最多上样30ul。

电泳：浓缩胶80V；分离胶120V（100V也可），电压越大分离越快，电....