以E.coli JM109基因组为模板，分别以pQE-nlpE-F和pQE-nlpE-R、pQE-spy-F和pQE-spy-R为引物，通过高保真PCR扩增获得2个基因片段，大小分别为711 bp和486 bp。PCR程序：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 s。

。。LB培养基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，1×105 Pa灭菌20 min。

DNA制备：将过夜活化后的E. coli JM109按照1% (V/V)的接种量转接至30 mL新鲜LB液体培养基中，于37 ℃、120 r/min培养至OD600约为0.8时，向摇瓶中添加不同浓度(0.2%–0.8%，V/V)丁醇，继续培养90 min后，吸取菌液2 mL，于5510×g室温离心2 min，倒出上清培养基收集菌体，进行RNA的抽提。。

使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制性内切酶对pQE80L载体进行双酶切线性化，酶切条件为37 ℃酶切6–8 h。

。一步克隆连接体系为：50–200 ng线性化pQE80L，20–200 ng插入片段，2 μL 5×CE Ⅱ Buffer，1 μL Exnase ....